高效液相色譜法
1 與氣相色譜相比液相色譜的優點 ：與氣相色譜法相比，液相色譜法不(bù)那空受樣品揮發性和熱穩定性及相對分子(zǐ)質量的限制，隻要用北求把樣品制成溶液即可，非常适合于分離生物大(dà)分子(zǐ們來)、離子(zǐ)型化合物，不(bù)穩定的天然産物以及其他(tā)各種高購樹分子(zǐ)化合物等。此外，液相色譜的流動相不(bù)僅起到使樣品沿色譜柱離購移動的作用，而且與固定相一樣，與樣品分子(zǐ)發生選擇性的相門姐互作用，這就為(wèi)控制和改善分離條件提供了一個額外的可變快讀因素。而氣相色譜法采用的流動相是惰性氣體，對組分上們沒有親和力，僅起運載作用。
2 液相色譜特點 ：高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點、熱不(bù)穩定有機及還訊生化試樣的高效分離分析方法。
3 高效液相相色譜儀的組成 ：高壓輸液系統、進樣系看頻統、分離系統、檢測系統、數據處理系統。
4 流動相使用前必須脫氣。 常用的脫氣方法有遠樹 ：低(dī)壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時(shí)加熱請男或向溶劑吹氮氣)、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。
5 梯度洗脫 ：用兩種(或多種)不(bù木事)同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續改變上如流動相中溶劑的配比和極性，通(tōng)過流動相中極性的購匠變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效校自果。
6 高壓梯度(内梯度)： 特點是先加壓後混合。将溶劑用高地就壓泵增壓以後輸入色譜系統的梯度混合室，加以混員飛合後送入色譜柱。
低(dī)壓梯度(外梯度) ：特點是先混合後加壓師腦。在常壓下預先按一定的程序将溶劑混合後再用泵輸入色譜習數柱。
7 進樣系統 要求 ：良好(hǎo)的密封性，最小的死體積，最好(h南器ǎo)的穩定性，進樣時(shí)對色譜系統壓力、流量影響較小。
8 分離系統： 色譜柱是實現分離的核心部件訊計。由柱管和固定相組成。柱管為(wèi)直型不(bù)鏽鋼管。一般書到色譜柱長(cháng)5~30 cm，内徑4~5議笑 mm，凝膠色譜柱内徑3~12 mm，而制備色譜柱内徑則可達白木25 mm。一般淋洗溶劑在進入色譜分離柱之前，先通(tōng)過前置柱。H又空PLC柱的填料顆粒粒徑一般約為(wèi)3長為~10 m，填充常采用勻漿法。色譜柱的發展趨勢是減小填料西秒粒度和柱徑以提高柱效。
9 檢測系統 ：作用——用來連續監測經色譜柱分離後的姐舊流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見知場吸收檢測器(qì)、光電二極管陣列檢測器(綠湖qì)、示差折光檢測器(qì)、熒光檢測器(qì)習新、電化學檢測器(qì)。
10 高效液相色譜法對流動相的要求 ：流動相不(bù)與色譜柱發生不(bù技飛)可逆化學變化，以保持柱效或柱子(zǐ)的保留性質較長(ch和道áng)時(shí)間不(bù)變;對待測樣品有足夠的溶解能力;與所用檢測器(看科qì)相匹配;粘度盡可能小，以獲得(de)較高的店藍柱效;流動相純度要高，價格便宜，毒性小。
11 高效液相色譜法的固定相的分類 ：
(1)按固定相承受壓力分：剛性固體：以二氧化矽為(哥農wèi)基質，可承受較高壓力，表面可鍵合相女各種功能官能團---鍵合固定相，是目前應用最廣泛的固定相。費中硬膠：主要用于離子(zǐ)交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯睡讀而成，可承受的壓力較低(dī)。
(2)按孔隙深度分：表面多孔型：基體是球形金分玻璃珠，在玻璃表面塗覆一層多孔活性物質如(rú)矽膠、氧化鋁、聚酰通話胺、離子(zǐ)交換樹脂、分子(zǐ)篩等。優點：适用于快速分離、填充均勻緊密海山、機械強度高、能承受高壓，适于簡單的樣品及常規分析湖花:缺點：多孔層薄，進樣量受限制。全多孔型：由矽膠顆粒林暗聚集而成，比表面積大(dà)，柱容量大(dà)，小顆粒全孔型固定相孔熱公洞淺傳質速率快，柱效高，分離效果好(hǎo)，适合于複雜都樹樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應用最廣泛的固定相。
12 液固吸附色譜法原理： 是以固體吸附劑為(wèi)固定相，吸附劑表為文面的活性中心具有吸附能力，試樣分子(zǐ很劇)被流動相帶入柱内時(shí)，它将與流近動動相溶劑分子(zǐ)在吸附劑表面發生競争吸附。分到開離過程是一個吸附-解吸的平衡過程。
13 液固吸附色譜法固定相 ：通(tōng)常是矽膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附分媽劑。矽膠最常用。流動相： 極性大(dà)的試樣需用極性強的洗脫道鄉劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應用 ：幾何異構體分離和族分離，如(r東媽ú)農藥異構體;石油中烷、烯、芳烴的分離。不(bù)适于強極性的離子司電(zǐ)型樣品的分離，不(bù)适于分離同系物(因為(wèi)它對相對分子(腦在zǐ)質量的選擇性較小)。
14 液液分配色譜法原理 ：根據物質在兩種互不刀愛(bù)相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不(bù)同實現分離。分配系數較大通到(dà)的組分保留值也較大(dà)。
15 液液分配色譜法流動相 ：流動相與固定液應盡量不(b為報ù)互溶，或者二者的極性相差越大(dà)越好(hǎo)化好。根據流動相與固定相極性的差别程度，可将液液色譜分為(木房wèi)正相分配色譜(流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，适于件子強極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動相極性大(dà)于固定相極性，弟笑極性大(dà)的先流出，适于非極性或弱極性組分分離)。固定相舊內 ：由載體和固定液組成。常用的固定液有b,b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、鄉們正十八烷、角鲨烷等。應用 ：同系物組分的分離。例：分離水解蛋白質所生成的各種厭房氨基酸，分離脂肪酸同系物等。
16 化學鍵合固定相 ：化學鍵合固定相是利用化學反應将有機分子(zǐ)鍵合到載鐘匠體表面上，形成均一、牢固的單分子(zǐ)薄層而構成各刀會種性能的固定相。
 17 化學鍵合固定相的特點 ：文又固定相不(bù)易流失，柱的穩定性和壽命較高;能耐受答讀各種溶劑，可用于梯度洗脫;表面較為(wèi)友也均一。沒有液坑，傳質快，柱效高;能鍵合不(bù)男厭同基團以改變其選擇性。例如(rú)，鍵合氰基、氨農厭基等極性集團用于正相色譜法，鍵合離子(zǐ)交換基團用于離子(zǐ)愛師色譜法，鍵合C2，C4，C6，C8，C18，C16，C女術18，C22烷基和苯基等非極性基團用于反相色譜法等。因此，它是HP鐘拿LC較為(wèi)理想的固定相。
18 離子(zǐ)交換色譜法原理 ：離子(zǐ下好)交換色譜法的固定相是離子(zǐ)交換樹脂，流動相是水溶液，它是利用河些待測樣品中各組分離子(zǐ)與離子(zǐ)交換樹脂的親和力的不(bù)同而進子這行分離的。
19 離子(zǐ)交換色譜法流動相 ：水的緩沖溶液。陰離子(zǐ)購弟離子(zǐ)交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液;陽離子(zǐ)離子高睡(zǐ)交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液;應用：離子(zǐ)及可離解的化長聽合物，氨基酸、核酸等。
20 凝膠色譜法原理 ：凝膠色譜法的固定相為(wèi)多孔性凝膠類物質，流動相樂計為(wèi)水溶液或有機溶劑，它是根據不(bù)同組分分子(zǐ)體積的通件大(dà)小進行分離的。小分子(zǐ)可以擴散到凝膠空隙，由其中通(tōng嗎舞)過，出峰最慢;中等分子(zǐ)隻能通(tōng)商西過部分凝膠空隙，中速通(tōng)過;而大(dà)分子(zǐ)被線還排斥在外，出峰最快;溶劑分子(zǐ)小，故在最後出峰。全部在死體如上積前出峰;可對相對分子(zǐ)質量在100-105範圍内知麗的化合物按質量分離。
21 凝膠色譜法流動相 ：能溶解樣品且與凝膠相秒腦似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、議喝水等。
22 影響分離的因素與提高柱效的途徑 :
(1)液體的黏度比氣體大(dà)一百倍，密度為(wèi)氣體看好的一千倍左右，故降低(dī)傳質阻力是提高友麗柱效主要途徑。
(2)由速率方程，降低(dī)固定相粒度可提高柱效。
(3)液相色譜中，不(bù)可能通(tōng)過增加柱溫站務來改善傳質。
(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。
(5)流速大(dà)于0.5 cm/s時(shí), H～u曲線是一段林票斜率不(bù)大(dà)的直線。降低(dī)流街店速，柱效提高不(bù)是很大(dà)。但在實際從頻操作中，流量仍是一個調整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數物地。
(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用學水原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備嗎相是一項技術要求非常高的工(gōng)作，一般很少自行制備。